Подсчет тромбоцитов. Подсчет тромбоцитов по фонио Считать тромбоциты в камере горяева

Норма: 180–320×109/л (200–400×109/л)
Тромбоциты (кровяные пластинки) – это безъядерные клетки диаметром 2–4 мкм, являющиеся «осколками» цитоплазмы мегакариоцитов костного мозга.

Морфология тромбоцитов

В крови здорового человека при световой микроскопии (окраска
по методу Романовского – Гимза) различают четыре основные формы тромбоцитов:

1. Нормальные (зрелые) тромбоциты (87,0 ± 0,13 %) – круглой или овальной формы диаметром 3–4 мкм; в них видна бледно-голубая наружная зона (гиаломер) и центральная (грануломер) с азурофильной зернистостью.

2. Юные (незрелые) тромбоциты (3,20 ± 0,13 %), несколько больших размеров с базофильной цитоплазмой, азурофильная грануляция (мелкая и средняя) располагается чаще в центре.

3. Старые тромбоциты (4,10 ± 0,21 %) могут быть круглой, овальной, зубчатой формы с узким ободком тем ной «цитоплазмы», с обильной грубой грануляцией, иногда наблюдаются вакуоли.

4. Формы раздражения (2,50 ± 0,1 %) больших размеров, вытянутые, колбасовидные, хвостатые, «цитоплазма» в них голубая или розовая, азурофильная зернистость рассеяна или разбросана неравномерно.

Гиаломер тромбоцитов (основа пластинки) ограничен трехслойной мембраной, которая, по-видимому, идентична мембране других клеток кроветворной ткани. Мембрана клетки инвагинирует и соединяется с сетью многочисленных каналов (так называемая открытая канальцевая система – ОКС), которые тесно переплетены внутри тромбоцита.

Наружная клеточная оболочка и ОКС усеяны гликопротеинами, играющими важную роль в адгезии и агрегации тромбоцитов.

В цитоплазме тромбоцитов можно обнаружить 4 вида гранул различной структуры, формы и величины, равномерно распределенные в кровяной пластинке или чаще собранные в ее центре (грануломер).

Наиболее многочисленные α-гранулы содержат тромбоцитоспецифические и тромбоцитонеспецифические пептиды, участвующие в механизмах коагуляции, воспаления, иммунитета и репарации.

Плотные гранулы представляют собой богатое хранилище АДФ и серотонина – веществ, способствующих агрегации тромбоцитов; а также антиагреганта АТФ и основного кофактора коагуляции Са2+. Лизосомальные гранулы содержат гидролитические ферменты, а пероксисомы – каталазу.

Функции тромбоцитов

Основные функции тромбоцитов

Запуск немедленного гемостаза за счет адгезии и агрегации тромбоцитов, что приводит к формированию тромбоцитарной пробки;
местное выделение вазоконстрикторов для уменьшения кровотока в пораженном участке;
катализ реакций гуморальной системы свертывания с образованием в конечном счете фибринового сгустка;
инициирование репарации ткани;
регулирование местной воспалительной реакции и иммунитета.

Нестимулированные тромбоциты циркулируют в виде гладких дискоидных клеток с незначительной метаболической активностью. Такие тромбоциты не вступают в физиологически значимое взаимодействие с другими форменными элементами крови или монослоем эндотелиальных клеток.

Физиологическая активация тромбоцитов начинается только тогда, когда поврежден сосудистый эндотелий и обнажен субэндотелиальный внеклеточный матрикс. В тромбоцитарной мембране возникают волны возбуждения и формируется большое количество коротких нитевидных псевдоподий или филоподий. В результате этого процесса значительно увеличивается площадь поверхности мембраны, что необходимо для катализа реакций гуморальной системы. С инициированием активации тромбоцитов внутриклеточные органеллы сосредотачиваются в центре клетки, после чего происходит слияние мембран плотных и α-гранул друг с другом, с клеточной мембраной и с мембранами ОКС. Это приводит к экзоцитозу содержимого гранул в наружную микросреду. Происходящий в это время каскад аутоактивации тромбоцитов, синтез ромбоксана и выделение содержимого гранул приводят к появлению тромбоцитарного агрегата, прошитого фибриногеновыми мостиками с участием гликопротеина мембранных рецепторов соседних тромбоцитов.

Известно, что мегакариоциты синтезируют и депонируют в α-гранулах факторы свертывания V, VIII, XIII и фибриноген, которые выбрасываются в микросреду при активации тромбоцитов. Тромбоцитарные мембраны играют не менее важную роль в запуске специфических реакций свертывания.

Методы подсчета тромбоцитов

Метод Фонио

Наиболее распространенный метод подсчета тромбоцитов – метод Фонио (готовят мазок и красят его по Романовскому – Гимза; считают количество тромбоцитов, встретившихся при подсчете 1000 эритроцитов).

Подсчета тромбоцитов в камере Горяева

Существует также метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева: кровь разводят 1% раствором оксалата аммония, или раствором, приготовленным по сложной прописи (см. ниже), или 5–7% раствором трилона Б (для предотвращения свертывания крови и агглютинации кровяных пластинок), заполняют камеру и подсчитывают тромбоциты по обычному правилу.

Метод люминесцентной микроскопии

Меньшее распространение получили методы определения количества тромбоцитов с помощью люминесцентной микроскопии.

Метод подсчета с использованием электронно-автоматических счетчиков

В настоящее время наиболее перспективен метод подсчета с использованием электронно-автоматических счетчиков в разведенной пробе после лизиса эритроцитов (для подтверждения данных лабораторного анализа необходимо исследовать мазок периферической крови).

Количественное определение тромбоцитов

Количественное определение тромбоцитов по методу Фонио

Капилляром Панченкова набирают 14% раствор сернокислого магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в количестве 25 мкл (до метки «75») и вносят в пробирку;
кровь из пальца набирают полный капилляр (до метки «0») и выливают всю кровь в пробирку;
содержимое пробирки тщательно перемешивают и из смеси готовят мазок, который фиксируют и окрашивают по Романовскому – Гимза. Если в качестве стабилизатора был взят раствор сернокислого магния, то продолжительность окраски составляет 2–3 часа, а при использовании раствора ЭДТА – 30–45 минут;
наносят на край мазка – в тонкой его части – иммерсионное масло;
считают количество тромбоцитов, встретившихся при подсчете 1000 эритроцитов; при подсчете, чтобы не сбиться, рекомендуется прибегать к ограничению поля зрения путем применения окуляров, поле зрения которых разделено сеткой.

Зная количество эритроцитов в 1 мкл крови и число тромбоцитов на 1000 эритроцитов, вычисляют количество тромбоцитов в 1 мкл крови.

где Э – число эритроцитов в 1 мкл.

Количественное определение тромбоцитов в камере Горяева

В пробирку наливают 4 мл раствора, приготовленного по сложной прописи (3 г кокаина солянокислого, 0,25 г хлористого натрия, 0,025 г фурацилина, 100 мл дистиллированной воды)* или 4 мл 1% раствора оксалата аммония;

* На практике в клинических лабораториях, ввиду принадлежности кокаина к наркотическим веществам, используют пропись следующего состава: новокаина гидрохлорида 3,5 г; натрия хлорида 0,25 г; воды дистиллированной до 100 мл. Время гемолиза эритроцитов составляет около 60 мин.

капиллярной пипеткой набирают 20 мкл крови, осторожно выдувают ее в пробирку с реактивом и ополаскивают пипетку. Смесь хорошо перемешивают и оставляют на 25–30 минут для гемолиза эритроцитов;
после повторного перемешивания заполняют камеру Горяева, которую помещают во влажную камеру;
через 5 минут производят подсчет количества тромбоцитов в 25 больших квадратах с использованием фазово-контрастного устройства.

Формула для подсчета тромбоцитов:

где а – количество тромбоцитов в 400 малых квадратах;
П – степень разведения (200).

Количественное содержание тромбоцитов

Норма: 180–320 × 109/л (200–400 × 109/л)

Увеличением количества тромбоцитов характеризуются:

миелопролиферативные процессы (эритремия, миелофиброз);
хронические воспалительные заболевания (ревматоидное поражение суставов, язвенный колит, туберкулез, остеомие лит, цирроз печени);
злокачественные новообразования (рак, лимфома, лим фо гра нуле матоз);
кровотечения, гемолитическая анемия;
период выздоровления при мегалобластных анемиях;
после операций;
состояние после спленэктомии;
лечение кортикостероидами.

Уменьшением количества тромбоцитов (тромбоцитопенией) характеризуются:

наследственные тромбоцитопении, вызванные снижением образованиятромбоцитов(врожденнаятромбоцитопения, синдром Уискотта-Олдрича, синдром Бернара – Сулье, аномалия Чедиака – Хигаси, синдром Фанкони, краснуха новорожденных, гистиоцитоз);
болезни крови (апластическая анемия, мегалобластные анемии, лейкозы);
поражение костного мозга (метастазы новообразований, туберкулезное поражение, ионизирующее облучение);
другие заболевания (циклическая тромбоцитопения, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, гемолитико-уремический синдром, почечная недостаточность, заболевания печени, опухоли сосудов, селезенки, эклампсия, гипертиреоз, гипотиреоз);
инфекции (вирусные, бактериальные, риккетсиозы, маля рия, токсоплазмоз, ВИЧ-инфекция);
беременность, менструации;
действие лекарственных препаратов (цитостатиков, анальгетиков, антигистаминных средств, антибиотиков, психотропных лекарств, диуретиков, противосудорожных средств, витамина К, резерпина, дигоксина, гепарина, нитроглицерина, преднизолона, эстрогенов и др.);
действие алкоголя, тяжелых металлов;
тромбоцитопении, вызванные повышенным потреблени ем тромбоцитов (тромбоцитопеническая пурпура, гиперспленизм, ДВС-синдром, кровотечения, гемодиализ).

Кровяные пластинки обладают групповой специфичностью, соответствующей групповой специфичности эритроцитов. Это должно учитываться при переливании тромбоцитарной массы.

В камере Горяева.
По Фонио.
При помощи люминесцентной микроскопии.
С применением электронно-автоматических счётчиков.

Подсчёт обычно производится по методу швейцарского хирурга начала 20 века А.Фонио.

Метод Фонио

Подсчёт тромбоцитов по Фонио ― это самый распространённый метод.

Преимущество которого заключается в том, что тромбоциты учитываются не в жидком объёме, а в окрашенном мазке:

клеточные элементы хорошо видны;
исследовать материал можно в любое время, а не сразу после получения биологического материала;
облегчается их «привязкой» к одной тысяче эритроцитов в 1 мл крови.

Кожу пациента протирают досуха.

Возможны два варианта действий лаборанта:

На место взятия анализа наносится небольшая капля 14% магнезии для предупреждения свёртывания крови. Полученную каплю крови смешивают с раствором и распределяют по предметному стеклу. Мазок сушат и окрашивают.
В пробирку вносят 25 мкл 14% магнезии или 6% ЭДТА и полный стеклянный капилляр крови, полученной из пальца, смешивают инвитро и готовят мазок. Время его высушивания зависит от реактива (2-3 часа при магнезии, 45 минут при ЭДТА). Затем окрашивают.

При исследовании мазка применяют окуляры с полем зрения, разделённым на квадраты, что облегчает подсчёт клеточных элементов.

В каждом квадрате считают эритроциты и тромбоциты. Подсчёт ведётся до обнаружения ровно одной тысячи эритроцитов.

Число тромбоцитов составляет абсолютную величину в промилле по отношению к эритроцитам (‰).

Зная общие цифры эритроцитов в 1 мкл крови, нужно умножить его на результат промилле для определения содержания в 1 мкл крови тромбоцитов:

Т = , где Т ― количество тромбоцитов, Э ― число эритроцитов в 1 мкл.

Исследование по Фонио может иметь погрешности, связанные с плохим качеством мазка и неравномерным распределением по стеклу тромбоцитов.

Подсчёт в камере Горяева является более точным, его погрешность всего 6,5%, но он более трудоёмкий и должен проводиться немедленно после взятия крови.

Для проведения метода кровь разводят реактивом для лизиса эритроцитов в 200 раз, вносят пипеткой в сетки камеры, настраивают фазово-контрастное устройство и под микроскопом считают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Для нахождения числа тромбоцитов в 1 мкл крови полученные цифры перемножают на 2000.

Коррекция уровня тромбоцитов

При несоответствии числа тромбоцитов по Фонио норме нужна помощь врача.

Повысить уровень тромбоцитов можно при помощи некоторых кортикостероидов, витаминов, препаратов-коагулянтов Дицинон, Этамзилат, Викасол, Револейт, Содекор.

Для укрепления сосудистой стенки полезна аскорбиновая кислота. В рационе должны быть мясо, морепродукты, гранаты, тыква, шиповник, свёкла, зелень.

Для снижения уровня тромбоцитов назначают препараты магния. В диете должны присутствоватьтакие продукты как лук, чеснок, рыбий жир, оливковое и льняное масло, томатный сок, яблочный уксус, зелёный чай.

Правильный сбалансированный рацион ― залог здорового равновесия свёртывающей системы крови.

Общий анализ крови включает исследование количественного состава клеток крови: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

В лабораториях используют автоматические гематологические счетчики, но методы микроскопического анализа остаются наиболее информативными и точными. Один из таких методов – микроскопия мазка по Фонио для подсчета количества тромбоцитов.

Микроскопию мазка используют в тех случаях, когда результаты исследований автоматического подсчета гемоанализаторами значительно отклоняются от нормы. Тромбоциты по Фонио подсчитываются по формуле, привязанной к значению абсолютного количества эритроцитов в крови. Поэтому методика является частью общего исследования крови и выполняется после автоматического подсчета количества других клеток крови (эритроцитов).

Тромбоциты

Тромбоциты – безъядерные клетки, образуемые из мегакариоцитов костного мозга. После созревания и попадания в кровь клетка живет 5-7 суток. Старые клетки утилизируются печенью и селезенкой. Процесс старения у этих клеток особо выражен.

Тромбоциты, как и другие клетки крови, делятся на юные, зрелые и старые. В норме в крови содержится не менее 95% зрелых клеток. Выброс в кровь незрелых клеток может быть вызван фактором раздражения (множественные повреждения сосудов). В крови могут быть обнаружены и дегенеративные, старые клетки, что свидетельствует о патологии процесса созревания и утилизации.

Тромбоциты – главные участники процессов тромбообразования. Вместе с тем, выделяя особые ферменты, они стимулируют деление клеток и регенерацию тканей, регулируют уровень проницаемости мембран клеток, поддерживают эластичность стенок сосудов.

По их количеству можно определить состояние здоровья сердечно-сосудистой системы. Повышенное количество называют тромбоцитозом, пониженное – тромбоцитопенией.

Функции клеток

Тромбоциты хорошо окрашиваются красителями. В зависимости от степени зрелости клетки окрашиваются с разной интенсивностью, что упрощает дифференциальную диагностику их морфологического состава.

Метод подсчета тромбоцитов по Фонио

Клетки подсчитывают разными способами. Камера Горяева и метод Фонио принципиально похожи и являются самыми распространенными. Суть метода Фонио заключается в параллельном подсчете окрашенных клеток эритроцитов и тромбоцитов в полях сетки микроскопа. В камере Горяева эта сетка нанесена лазером на само стекло.

Подсчет тромбоцитов по Фонио выполняют с использованием недорогих реактивов:

В качестве коагулянта применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА);
Для фиксации мазка используют раствор Лейшмана (раствор эозин-метиленовой синьки в метаноле).
Эозиновый краситель Гимзы для окраски по Романовскому.

Метод подсчета тромбоцитов по методу Фонио популярен не только из-за простоты и низкой себестоимости. В отличие от подсчета тромбоцитов в камере Горяева микроскопию мазка по Фонио можно выполнить через несколько часов или дней после сдачи анализа. Лабораториям, заваленным текущими заявками, это позволяет снизить пиковые нагрузки, связанные с утренними наплывами пациентов.

Кроме того, возможность повторной микроскопии через несколько дней позволит сравнить показания или уточнить результат подсчета.

Выполнение анализа

Для анализа используется капиллярная кровь (из пучки пальца).

После прокола пучки первая капля не используется, ее удаляют ваткой. Для мазка берут вторую каплю. Обычно коагулянт добавляют в выступившую каплю крови и сразу помещают образец на стекло. Но лаборант может смешивать кровь с коагулянтом в пробирке.

Мазки фиксируются и окрашиваются методом Паппенгейма. При нанесении на приготовленный мазок крови нескольких капель раствора фиксатора клетки приклеиваются к стеклу. Гематологические фиксаторы способны прокрашивать клетки, что ускоряет процесс подготовки мазка.

Затем на мазок наносят несколько капель краски Гимзы-Романовского и выдерживают 2-3 ч. (с использованием магнезии) или 30-45 мин. (с использованием в качестве коагулянта ЭТА). В результате клетки крови окрашиваются и хорошо просматриваются для ручного подсчета.

После промывания мазок высушивают в сушильном шкафу и приступают к исследованию при помощи микроскопа, оснащенного иммерсионным объективом и сегментированными окулярами.

Подсчет тромбоцитов

Сетка, нанесенная на окуляры, облегчает подсчет тромбоцитов в мазке крови. Лаборант считает число клеточных элементов по секторам этой сетки.

Мазок под микроскопом

Параллельный подсчет количества эритроцитов и тромбоцитов начинают с одного сектора, и, передвигая окуляр, переходят к следующему сектору. Подсчет заканчивают, когда число эритроцитов достигнет 1000.

Важно! Погрешность метода обусловлена тем, что при подсчете учитывают только скопления этих клеток. Отдельно расположенные одиночные клетки не учитывают.

После того как получено число тромбоцитов, привязанное к 1000 клеток эритроцитов, приступают к вычислению абсолютного количества клеток в единице объема крови. Для этого понадобится значение абсолютного количества эритроцитов крови данного пациента, полученное в автоматическом анализаторе.

Расчет выполняют по такой формуле: значение абсолютного количества эритроцитов делят на 1000 и умножают на число подсчитанных при микроскопии тромбоцитов:

где T – число подсчитанных тромбоцитов, E – абсолютное число эритроцитов.

Достоверность результатов

Низкое качество оборудования и нечеткое следование методике исследования может повлиять на достоверность результата. Причины получения искаженных данных:

Использование некачественных химикатов;
Неправильная подготовка растворов;
Несоблюдение сроков окрашивания;
Неправильный режим сушильной камеры.

В условиях массового выполнения микроскопии особое значение имеет правильная организация работы, маркировка и хранение образцов.

Получение объективных результатов зависит не только от правильного выполнения всех требований методики лаборантом, но и от самого пациента. Он должен ответственно подойти к процедуре обследования и подготовиться к сдаче анализа:

Забор крови выполняют на голодный желудок, поэтому пациент должен отказаться от приема пищи за 8 часов до визита в лабораторию.
Если образ жизни пациента или условия его работы связаны с постоянными физическими нагрузками, рекомендуется за 2 дня до анализа их ограничить.
Любители алкоголя должны помнить, что прием этилового спирта провоцирует многократный подъем тромбоцитов.
Эмоциональные стрессы тоже негативно сказываются на картине крови, поэтому несколько дней в преддверии сдачи анализов нужно провести в спокойной обстановке.

Описания некоторых лекарств (гепарин, простагландин, аденозин) содержат информацию о том, что препарат временно может влиять на состав крови. Пациент обязательно должен поставить врача в известность о любых принимаемых препаратах. Врач оценит вероятность искажения результатов анализа и примет взвешенное решение о временной отмене этого средства.

Расшифровка результатов, причины отклонений

В стандартном лабораторном бланке тромбоциты обозначаются PLT. Единица, в которой представлены результаты, – тысячи единиц на микролитр. Обычно в лабораторных бланках для сравнения указана и норма.

Норма для мужчин – 200–400 тыс./микролитр;
Для женщин – от 180 до 320 тыс./ микролитр.

Норма для детей:

У новорожденных до 2 недель – от 100 до 420 тыс./ микролитр;
У малышей до года – от 150 до 350 тыс./ микролитр;
У детей до 5 лет – 180-380 тыс./ микролитр;
У детей до 7 лет – от 180 до 150 тыс./ микролитр.

В период менструации отмечается нормальное (физиологическое) понижение клеток (75-200 тыс./мкл). Двукратное сокращение количества тромбоцитов связано с необходимостью отторжения эпителия матки. Снижение тромбоцитов у беременных (100-300 тыс./мкл) тоже считается нормальным.

Во время менструации сдавать анализ на тромбоциты не рекомендуется.

Высокие тромбоциты

Тромбоцитоз, вызванный патологией стволовых клеток в костном мозге, называют первичным.

Физиологическое повышение тромбоцитов как реакцию организма на травму, употребление алкоголя, инфекцию или отравление называют вторичной. Механизм такой реакции связан с усиленным выбросом тромбопоэтина, который стимулирует деление и рост тромбоцитов в костном мозге.

Тромбоцитоз может возникнуть в результате таких заболеваний:

Туберкулез;
Миелолейкоз;
Анемия;
Артрит;
Эритроцитоз;
Лимфогранулематоз;
Острые инфекции;
Рак печени, почек.

Отравление, стресс и интенсивная физическая нагрузка способны вызвать увеличение количества тромбоцитов.

Важно! При обильных кровопотерях на фоне уменьшения объема крови уровень тромбоцитов снижается только в первые часы, а через несколько часов уровень может повыситься в несколько раз.

Низкие тромбоциты

Причиной тромбоцитопении зачастую становится бесконтрольное самолечение препаратами, побочным эффектом которых и становится развитие тромбоцитопении.

Причиной тромбоцитопении могут быть такие заболевания:

Болезни печени (гепатит, цирроз);
Нарушение функции щитовидной железы (гипертиреоз, гипотиреоз);
Отдельные виды лейкоза;
Мегалобластная анемия;
Алкоголизм.

При затяжной тромбоцитопении стенки сосудов становятся хрупкими, незначительные порезы и повреждения сосудов приводят к длительному кровотечению.

Для уточнения причины низких тромбоцитов и назначения терапии пациенту придется пройти множество дополнительных обследований (УЗИ печени, селезенки, тест на антитела, МРТ). Анализ крови на число тромбоцитов по Фонио нужно будет сдавать регулярно.

Как нормализовать показатели тромбоцитов

Когда тромбоциты понижены, врач назначает медикаментозную терапию. Но пациент может сделать процесс лечения эффективнее:

Снизить потребление соли, алкоголя, исключить из рациона морскую капусту, красные сорта винограда;
Включить в ежедневный рацион рыбу, печень, гречку, орехи, яблоки, сельдерей, сладкий перец.
Не принимать лекарства, которые вызывают тромбоцитопению (антибиотики, антидепрессанты).
Принимать синтетические витаминные комплексы, включающие витамины группы А, В, С.

При высоких показателях снизить уровень тромбоцитов можно при помощи нормализации образа жизни, уменьшения стрессов, травм. Из медикаментов снизить тромбоциты поможет ацетилсалициловая кислота. Дозы препарата назначает только врач.

где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови, а – число лейкоцитов в 100 больших квадратах, 20 – разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250 -объем одного большого квадрата 1/250.

Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50.

При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда.

Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе) – 45*109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100 лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).

Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:

150 клеток (общее количество – 45*109/л (количество клеток в 1 мкл, лейкоцитов и нормобластов, полученное при подсчете в камере полученное при подсчете или на анализаторе)

100 клеток (лейкоциты) – Х (истинный лейкоцитоз крови)

Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 * 109/л.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.

Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата).

Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис

лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа. (Луговская и др., 2002)

2.3 Методы подсчета количества тромбоцитов.

Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в счет ной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.

Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.

Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода – необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его – возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови.

Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему. (Луговская и др., 2002)

Метод подсчета в камере.

Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.

Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25-ЗО мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру. Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты считают в 25 больших квадратах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований.

Расчет тромбоцитов проводят по формуле:

где Х – число тромбоцитов в 1 мкл крови; а – число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах, 200 – разведение крови, 25 – число сосчитанных квадратов, 250 – объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных тромбоцитов умножают на 2000.

Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. (Клиническая лабораторная аналитика, 1999)

Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75 и вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”. Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).

Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови.

Например: А=60‰; число эритроцитов 5 *1012/л

Составляют пропорцию: 60 – 1000

Х – 5*1012/л, откуда

Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0 * 109/л

В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов (фирма «Гем»). (Луговская и др., 2002)

Для подсчета и анализа клеток крови используют ручные микроскопические методы и гематологические счетчики разного уровня автоматизации. В настоящее время необходимо внедрение технологий автоматического изучения клеточного состава крови, для того чтобы добиться высокого качества и точности исследований, исключая ошибки, зависящие от работы лаборантов. Клинические лаборатории нуждаются в разработке новых более совершенных методов.

Тромбоциты участвуют во всем процессе свертывания крови, начиная от образования первичного тромба в области повреждения кровеносных сосудов и заканчивая участием в процессах регулирования проницаемости и тонуса сосудов.

Подсчет максимально точного количества тромбоцитов осуществляется при помощи камеры Горяева и метода Фонио. Подсчет тромбоцитов по Фонио довольно точен. Метод Фонио является наиболее удобным именно при автоматическом подсчете.

Необходимые реактивы

Для определения точного количества тромбоцитов по данному методу потребуются такие реактивы как:

раствор сульфата магния 14% (обязательно стерильный);
краситель Романовского – Гимзы;
фиксаторы Лейшмана либо Май-Грюнвальд.

Как готовится препарат

Кожа пальца вытирается максимально на сухо и аккуратно прокалывается.

Затем на кожу наносят маленькую капельку раствора сульфата магния и после смешивают его с выделившейся каплей крови. Из получившейся смеси готовят мазки, которые высушивают и открашивают по Паппенгейму.

Как считаются тромбоциты

В мазке, подвергнутом окрашиванию, считают 1000 эритроцитов и все попавшиеся тромбоциты. В итоге получается число, выражаемое промилле. Чтобы получить абсолютное количество тромбоцитов нужно данную величину перемножить на количество эритроцитов, имеющихся в 1 мкл, а затем разделить на 1000.

К примеру, если в мазках обнаружено 64 промилле тромбоцитов, эритроциты считаются 5 x 10 в 1 мкл, а тромбоциты 64 x 3,5 x 10 разделить на 1000 равно 224 x 10 в 3 степени в 1 мкл.